膝关节炎（knee osteoarthritis,KOA）属于一种慢性关节退化性疾病,其临床主要表现为关节变形、关节疼痛等,严重影响患者的日常生活与工作^[1]。临床上对于 KOA 的治疗以微创关节镜清除术为主,并于术后采用常规玻璃酸钠注射液保护关节组织,该药物具有一定的镇痛、消肿效果,但其耐药性较高,对于患者临床症状的缓解作用较低,不利于机体的恢复 。

中医认为KOA 属于“筋痹”“骨痹”等范畴,主要因筋骨养分不足,肝肾亏虚,致寒风侵入,体感风寒,湿邪入体所致^[2]。身痛逐瘀汤有活血祛瘀,益气强肾,通痹止痛的作用,本实验旨在证实其治疗效果并与临床常用药品进行疗效对照。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物SPF级雄性SD大鼠40只,体质量180±20ｇ。购自斯贝福( 北京) 生物技术有限公司，在标准动物饲养室内（室温：23±1℃，相对湿度：40%~60%）适应性饲喂1周

1.1.2试剂与仪器Rat IL-1β Elisa kit（美国Andy Gene 公司，货号：AD202205）；Rat MMP-13 Elisa kit（美国Andy Gene 公司，货号：AD202205）

1.2方法

1.2.1动物分组与造模 40只SPF级雄性SD大鼠通过SPSS软件随机均分为4组：假手术（Sham）组、模型（ACLT）组、逐瘀止痛胶囊组,塞来昔布（CLX）组4组,每组10只。采用改良前交叉韧带切除术（ACLT）造模。术后连续3d每天肌肉注射青霉素2×105U,2次/d,预防感染。置于标准动物饲养笼中允许其自由活动及进食,无特殊干预下继续饲养4周。4周后X射线片显示关节内侧间隙明显变窄、关节面粗糙变形、边缘有明显骨赘、软骨下骨骨密度增高鉴定模型成功。将药物提取液浓缩,按照成人70kg体重等倍剂量进行灌胃,每日一次。假手术组和模型组大鼠灌胃10mL/kg/d生理盐水；阳性药物组大鼠灌胃4mg/kg的塞来昔布10mg/kg/d。药物治疗共计6-8周。

1.2.2样本制备,用3%戊巴比妥钠麻醉大鼠,腹主动脉采血静置2h,随后以3000r/min,离心5min,分离出血清,-80℃保存备用。分离膝关节,生理盐水冲洗,手术刀缓慢剥离股骨内侧髁上的关节软骨,置于冻存管并保存于-80℃备用。每组选3只大鼠收集滑膜组织,于4%多聚甲醛固定,常规梯度乙醇脱水,石蜡包埋备用。每组选3只大鼠收集软骨组织,置于EDTA溶液中常温脱钙,每周更换脱钙液,完成后对标本进行修整,置于清水中冲洗,标本进行脱水、透明、浸蜡及包埋。

1.2.3HE染色石蜡包埋固定的滑膜,切片。石蜡切片放置60℃烘箱烤片1h；置于二甲苯I、二甲苯II各5min,置于无水乙醇I、无水乙醇II各3min,置于梯度乙醇（95%、80%、70%）各3min；水化2min。常规HE染色：苏木素溶液3min,纯水浸泡20s,酒精分化15s,自来水冲洗4min,伊红染色1min,梯度酒精脱水,二甲苯透明、封片,镜下摄片,观察滑膜组织形态学改变。

1.2.4番红固绿染色石蜡包埋固定的软骨组织,切片。石蜡切片放置60℃烘箱烤片1h；脱蜡水化后；滴加 Weigert 染液进行染色 4 分钟，稍水洗后使用酸性分化液进行分化 5 秒，在水中浸泡 5 min后滴加固绿染液染色15分钟，弃去固绿后晾干；番红染液染色 10 分钟后瞬时过水；95%乙醇中 5 秒；二甲苯Ⅰ、Ⅱ 各透明5min后进行封片。光镜采集图像,根据改良Mankin’s评分评估软骨退变程度。

1.2.5ELISA检测相关蛋白和炎症因子检测血清MMP-13、炎症因子 IL-β1的水平。

1.3统计学分析采用SPSS20.0统计软件进行数据分析

定量资料以均数±标准差（±s）表示,符合正态分布采用单因素方差分析,若方差齐,采用LSD法进行各组间两两比较；若方差不齐,则采用Games-Howell法进行两两比较,以P<0.05表示差异有统计学意义。

2结果

2.1 HE染色

各组HE染色结果对比观察

假手术组：软骨表面光滑，为淡蓝色，色泽透亮，关节表面未见纤维化及骨赘形成

模型组：关节软骨表层变粗糙变薄，表层很不完整，局部软骨增厚，软骨纤维化明显，可见部分区域软骨表面几乎被破坏殆尽；部分软骨细胞出现凋亡现象，细胞“背靠背”消失，排列较乱，呈增殖簇集现象；软骨潮线分布不规整，软骨基质纤维化；软骨下骨伴局部增生，并嵌入软骨层内，髓腔开放、扩大，致密层变薄。

中药组和塞来昔布组：两组的软骨表层裂缝较少，组织损伤程度轻于模型组，整细胞体排列较规整齐，局部区域排列欠齐，但总体上明显比模型组要好，软骨深层结构清晰，表层细胞形态结构较正常，组织各结构较规则，软骨潮线较规整，极少数部位出现细胞簇聚。（见图1）

图1 各组大鼠关节软骨病理HE染色（×200）

2.3番红固绿染色染色

番红固绿染色结果显示（见图2），假手术组关节软骨层厚薄均匀，染色正常，表面平整光滑，潮线清晰完整；与假手术组相比，模型组软骨表明缺损破坏，出现轻度失染，细胞减少，潮线不完整；塞来昔布组染色正常，软骨表明相对光滑平整，中药干预后，除中药低剂量外，其他各组软骨表面均相对平整，潮线完整清晰。

图2 各组大鼠关节软骨病理番红固绿染色（×200）

2.4ELISA检测相关炎症因子

ELISA法检测各组大鼠血清中IL-β1、MMP-13的表达水平，（见图3）。

与假手术组相比，模型组IL-β1、MMP-13均显著升高，差异有统计学意义（P<0.01），与模型组相比，塞来昔布组和中药给药组IL-β1、 MMP-13的表达水平较均显著降低，差异有统计学意义（P<0.05）。

注：与假手术组相比，**P<0.01；与模型组相比，##P<0.05；#P<0.01。

图3 各组大鼠血清中IL-β1、MMP-13的表达

3. 讨论

膝骨关节炎（knee osteoarthritis,KOA）的发病机制十分复杂，身痛逐瘀汤是清朝时期医学名家王清任的逐淤名方之一，本实验使用身痛逐瘀加减方，方中秦艽^[3]祛风湿、退虚热、舒筋止痛；当归^[4]补血活血、调经止痛；赤芍清热凉血、散瘀止痛；红花^[5]活血通经、散瘀止痛；牛膝逐瘀通经、补肝肾、强筋骨、引血下行；川芎^[6]活血行气、祛风止痛；香附行气解郁、调经止痛；羌活散寒祛风、除湿止痛；黄芪补气升阳、行滞通弊；片姜黄^[7]破血行气、通经止痛；杜仲^[8]补肝肾、强筋骨；地龙熄风、通利周身关节；甘草调和药性。诸药合用，共奏祛风除湿、通利关节、通痹止痛之功。

综上所述，本实验明确了身痛逐瘀汤加减对治疗KOA的作用，初步探索了其治疗机制。但本研究尚有不足，未能进行步态分析，在功能评定和康复疗效评价方面资料不全，且没有在分子生物学水平对探索本方可能的通路，并且在量效关系上没有进一步的研究，后续还需完善相关研究，以期能更好的服务临床。

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