变应性鼻炎（Allergic rhinitis，AR）又称过敏性鼻炎，主要由IgE介导的鼻黏膜非感染性的慢性炎性疾病。变应性鼻炎的发病率居高不下，且呈上升趋势，在全球当中受变应性鼻炎影响的人群大概10～20%，而我国成人的变应性鼻炎的标准化患病率由2005年的11.1%，已经升到2011年的17.6%^[1-3]。微小RNA（miRNA）是一种小的（20-25个核苷酸）非蛋白质编码RNA分子，通过切割和沉默靶转录物并抑制转录后过程来调节基因表达，在AR的发生及发展中已经有重要的研究^[4]。本研究旨在在变应性鼻炎中miRNA-21靶向调控IL-12p35的机制进行研究，为临床治疗AR提供必要的参考依据。

1. 材料与方法

1.1 研究对象

本研究搜集并整理了2023年9月至2024年3月15例在长沙市中心医院耳鼻咽喉科行鼻部手术的变应性鼻炎患者作为研究对象，15例在我院行鼻部手术的非变应性鼻炎患者作为对照组，年龄为18～59岁，其中男19例、女性11例。纳入标准：变应性鼻炎的诊断依据《中国变应性鼻炎诊断和治疗指南（2022年，修订版）》诊断，诊断依据为: (1)症状:阵发性喷嚏、清水样涕、鼻痒和鼻塞等症状出现 2 个或以上，每天症状持续或累计在1 h以上，可伴有流泪、眼痒和眼红等眼部症状; (2)体征:鼻部症状常为鼻黏膜苍白、水肿，鼻腔水样分泌物; (3) 过敏原检测:对尘螨过敏。排除标准:(1)自身免疫性疾病、急慢性感染;(2)严重的过敏性皮肤病或过敏性哮喘病史;(3)合并恶性肿瘤;(4)入院1个月内接受免疫、过敏性疾病药物治疗;(5)合并激素性、神经性、药物性、血管运动性鼻炎。

1.2 实验方法

1.2.1 标本收集及RT-qPCR

术中收取鼻部手术患者的鼻黏膜组织，将样品放至低温离心机中离心20分钟，转速为12000转；离心完成后，小心拿出EP管，取上清。将管壁液体弃去（注意不要把沉淀倒掉），擦干净管壁的液体。根据沉淀的量加入适量的DEPC水溶解沉淀，检测RNA的浓度（使用Nanodrop 2000 直接检测样本RNA浓度，用纯水矫正仪器）。按RNA试剂盒说明书提取总RNA，检测其浓度，取5000ng并按照逆转录试剂盒说明书操作得到cDNA。取2.0μl反转录产物对miRNA-21及IL-12p35进行qRT-PCR扩增检测，内参为β-actin。PCR反应体系为20 μl，按照RT-qPCR试剂盒说明书操作（PCR运行条件如下：94℃ 30 s，94℃ 5 s，55℃ 30 s，40个循环）。用2^-ΔΔCt法计算各组细胞中基因的相对表达量。

1.2.2 慢病毒转染

将细胞以2×10⁵/孔铺到6孔板中，待细胞密度达80%~90%，按照慢病毒产品手册，在6孔板中按照miRNA-21 mimics；NC mimics；miRNA-21 inhibitors；NC inhibitors，加入适量病毒悬液，在37℃、5%CO₂条件下的培养箱中进行培养，显微镜观察荧光蛋白，转染效率达80%时使用6 μg/ml嘌呤霉素筛选稳度表达细胞系。

1.2.3 双荧光素酶酶实验

根据生物信息学的方法预测miRNA-21与IL-12p35具有相互结合位点(h-IL-12p35-3UTR-AR:5'-ACGCCUGUAAUCCCAGCACUUUG-3',hsa-miRNA-21:3'-GAUGGACGUGAUAUUCGUGAAAU-5')。通过双荧光素酶实验验证，将用于转染的beas-2b 细胞放入96孔板中，待细胞密度达到50%-70%，将培养基与目的质粒以及目标基因充分混匀后室温放置（溶液A），之后将培养基与转染试剂充分混匀放置（溶液B），将溶液A与溶液B充分混匀，室温放置20min，将转染混合物加入96孔板混匀，37℃、5%CO2条件下的培养箱中进行培养48h后收集细胞，按照双荧光素酶报告系统试剂盒试剂盒进行检测。

1.2.4 cck-8实验

将转染好的培养后鼻腔黏膜细胞制备细胞悬液并计数后接种在96孔细胞培养板中（1×10⁴个细胞/μL/100孔），37℃，5% CO₂恒温恒湿培养箱分别培养0，24h，48h，72h。每孔加10 μL CCK-8 试剂，过程注意避光操作，继续培养2 h后用酶标仪测定在450 nm的吸光度，反应细胞增殖能力。

1.3统计学方法

采用GraphPad Prism 8统计软件进行分析，组织标本数据采用非参数检验进行比较；所有细胞学数据均为6 次独立实验结果，符合正态分布的数据用`x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P<0.05为差异具有统计学意义。

2. 结果

RT-qPCR结果显示：AR患者鼻黏膜组织中miRNA-21显著高于正常对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见图1。

转染后miRNA-21过表达组鼻腔黏膜细胞L-12p35表达水平显著高于过表达对照组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表1。

表1  qRT-PCR检测转染后各组细胞中IL-12p35表达水平

miRNA-21过表达组的IL-12p35野生型3'-UTR荧光素酶活性显著低于miRNA-21过表达对照组，差异有统计学意义（P＜0.05）；miRNA-21过表达组与过表达对照组的IL-12p35野生型荧光素酶活性比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；miRNA-21过表达组与过表达对照组的IL-12p35 突变型荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2  荧光素酶报告实验结果

cck-8实验结果显示，0h转染各组培养后鼻腔黏膜细胞吸光度值差异无统计学意义（P>0.05），过表达对照组24h、48h、72h细胞吸光度值低于miRNA-21过表达组，差异具有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3  CCK-8实验检测转染后各组培养后鼻腔黏膜细胞不同时间点细胞增殖生长曲线

3. 讨论

AR 的治疗原则为“防治结合，四位一体”，包括环境控制、药物治疗、免疫治疗和健康教育，口服抗组胺药和鼻用类固醇激素是目前控制变应性鼻炎症状最常见的方法，另外免疫治疗也被纳入了变应性鼻炎的一线治疗^[1,3,5]。

miRNAs是22个核苷酸的小非编码RNA，通过miRNA降解或翻译抑制来抑制基因表达，调节细胞功能，包括增殖、分化、免疫反应和肿瘤发生。正确的miRNA表达是免疫细胞正确分化所必需的。然而，这些miRNA作为诊断、预后和治疗应用的潜在生物标志物的功能仍有待澄清。既往研究表明，在自身性免疫性疾病中，患有湿疹和牛皮癣等炎症性疾病的患者血清中miRNA-21的水平明显升高^[6]。同样，在小鼠哮喘模型中，暴露于过敏原后，肺组织中miRNA-21表达也升高。此外，在类固醇不敏感的哮喘小鼠模型中，miRNA-21通过增强磷酸肌醇3-激酶介导的组蛋白去乙酰化酶2的抑制加重局部炎症。

IL-12是一种由多种免疫细胞产生的细胞因子，对于T细胞、自然杀伤细胞（NK细胞）和巨噬细胞的活化和功能调节至关重要。IL12p35是IL-12分子中的一个亚单位，它与另一个亚单位IL12p40结合形成功能活性的IL-12，进而调节机体反应。既往文献表明，miRNA-21靶位点位于IL-12 mRNA内，miRNA-21可以显著抑制IL-12转录后的翻译过程^[7]。我们的研究也表明在气道上皮细胞中miRNA-21通过调节IL-12的转录后翻译来参与AR局部炎症反应的调节。

综上所述，本研究提示miRNA-21通过调控IL-12p35的表达、促进AR患者鼻腔黏膜细胞增殖和抑制其凋亡，进而加重局部炎症，这为寻找AR诊断、发展及预后生物标志物提供了新思路。

参考文献：

[1] 孙鑫鑫,李家家,丁彩凤. miRNA-21的循环放大检测及成像[J]. 青岛科技大学学报（自然科学版）,2023,44(5):16-25,34.

[2] 马永,高辉,王明岗,等. miRNA-223、miRNA-21及miRNA-27a与冠心病冠脉病变的关系[J]. 分子诊断与治疗杂志,2024,16(2):361-364.

[3] 陈宇,黄国东,覃婷,等. miRNA-21在糖尿病肾脏病的作用机制及中药干预新进展[J]. 天津医药,2023,51(12):1387-1392.

[4] 杨红斌,王甜甜,张欣. 英夫利昔单抗联合miRNA-21抑制剂对肺癌A549细胞的影响[J]. 中华内分泌外科杂志,2023,17(2):234-238.

[5] 曾元清,邓宁波. 恒温扩增检测miRNA-21-5p系统的构建和初步评价[J]. 中国当代医药,2024,31(13):4-9.

[6] 王玉,席乐峰,杨廷桐. C-myc与肺鳞癌中miRNA-21表达的关系[J]. 解剖学杂志,2013,36(4):758-761.

[7] 刘海荣,谢斌辉,黄国红. miRNA-21转录调控因子的生物信息学分析[J]. 中山大学学报（医学科学版）,2016,37(1):148-154.