Compare with Liquid Culture and Solid Culture and Real-time Fluorescent Nucleic Acid Constant Temperature Amplification Detection Technology (SAT) for Ureaplasma Urealyicum(Uu) and research on drug resistance

Guo Yan, Lin Shuqiong, Zhao Wei, Lu Runrong, Zhang Jingming

Dongguan Dongcheng Hospital

Fund project: Dongguan Social Development science and technology project in 2022

Abstract：Objective: Comparcomparative analysis of the results of liquid culture, solid culture and SAT and the resistance of Uu infection in Dongguan. Methods: 1000 samples were selected for Uu test for liquid culture method, solid culture method and SAT method, and 158 samples with three detection methods were selected for consistency test and drug sensitivity test, and the results were analyzed. Results: The positive detection rate of liquid culture was 48%, 28% by solid culture and 45% by SAT. The positive agreement rate between liquid culture method and SAT method was 84.51%, the negative agreement rate was 81.60%, the total agreement rate was 82.91%; the positive agreement rate between liquid culture method and solid method was 84.09%, the negative agreement rate was 65.78%, the total agreement rate was 70.89%; the positive agreement rate of SAT method was 86.36%, the negative agreement rate was 71.05%, and the total agreement rate was 75.32%. The sensitivity of Uu to 10 drugs were sparfloxacin, doxycycline, xioxomycin, tetracycline, roxithromycin, clarithromycin, erythromycin, azithromycin, ofloxacin, and ciprofloxacin. Conclusion: The detection rate of Uu in liquid culture is higher than SAT than in solid culture; liquid culture is highly consistent with SAT; the top four most sensitive drugs are sparfloxacin, doxycycline, oxoxomycin and tetracycline.

解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)又称为溶脲脲原体，属于支原体科脲原体属，是1954年首次从非淋菌性尿道炎（Nongoncoccal Urethritis, NGU）患者尿道中分离分来的一种微生物。Uu体积极小，介于病毒和细菌之间，不存在细胞壁，抵抗温度改变与干燥环境的能力极强，是现阶段能在无生命培养基中进行生长繁殖的最小微生物。Uu存在于人和动物的腔道黏膜上，是人类泌尿生殖道中最常见的一种寄生菌，不仅引起泌尿生殖道感染还可阻碍精子运动干扰卵子受精引起不孕不育。其在人体定植可出现二次上升趋势，即分娩时，由母体产道感染新生儿，之后快速减少，开始性生活之后，又开始逐渐增多，不仅危害母体健康而且危害胎儿健康^[1]。Uu除了可引发NGU之外，还会造成前列腺炎、宫颈炎、自发性流产、早产等各种危害。近年来，由Uu感染引发的泌尿生殖道感染备受临床关注，已经发展成为一个严峻的公共卫生问题。Uu的检测方法有很多，包括分离培养法、分子生物学方法、免疫学检测等，不同检测方法的检测结果存在一定差异。培养法是临床用来判断Uu感染的一种较为传统的检测方式，同时也是金标准。培养法又包括液体培养法、固体培养法两种检测方式。同时，近年来的国内外报道显示，生殖系统感染性疾病的发病率呈逐年上升趋势，且已经发展成为性传播疾病的首位,多重耐药性的支原体菌株在临床上也不断增多^[2]。基于Uu检测的必要性与迫切性和在基层医疗机构可开展的方法实用性，本实验将我院已在应用的Uu液体培养法和刚刚开展的固体培养法同准备开展的SAT法对这三种方法检测结果进行对比分析其检测结果一致性，并在此基础上进一步分析东莞地区Uu感染的药物敏感性，现报告如下：

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1样本来源

选取我院2022年月5月1日至2024年10月31日因怀疑泌尿生殖道支原体感染行Uu检测的1000例样本，进行培养法（包括液体培养法、固体培养法）检测样本500例，行SAT法检测样本500例，其中同时行培养法和SAT法检测样本158例。

1.1.2样本采集

采集分泌物拭子标本（女性宫颈拭子，男性尿道拭子）或者尿液标本。生殖道拭子样本：在女性宫颈口或者男性尿道口1-2cm处取两份样本，一份用于SAT法检测用，一份用于液体培养和固体培养检测用。尿液样本：嘱咐受试者至少保持1h不排尿，收集2ml首段尿，均匀混合0.5ml尿液与0.5ml尿液保存液，低温保存备SAT法检测用，余尿备液体培养法和固体培养法检测用。

1.1.3仪器试剂

培养法所用试剂由江门凯琳贸易公司提供，SAT所用试剂及仪器均由上海仁度生物科技股份有限公司提供。

1.2方法

1.2.1液体培养参照试剂说明书，将培养基复温至常温25℃，以无菌方式将棉拭子直接接种在支原体ID2培养基中；立即转加样55μl到ST试剂条上的反应杯中，再滴两滴矿物油；封闭后加盖，将药敏试剂条和剩余的肉汤液体培养基，放置在36±2℃的普通培养箱环境中行24h、48h孵育。24h、48h孵育之后，对瓶中肉汤颜色变化进行读取，若为黄色，则可判定为阴性，若从橙色变为红色，则为阳性。与此同时，在24h、48h孵育之后，对反应杯值进行读取，药敏试剂条内含有20个反应孔，分上下两行，各有10个反应孔，上行（H）为高浓度药敏试验，下行（L）为低浓度药敏试验，反应孔决定10种抗生素药敏试验结果，具体见表1。

表1 药敏试验结果解释

1.2.2固体培养将培养基复温至常温25℃，采用无菌方式将将棉拭子直接接种在液体培养基中，于固体培养基的琼脂上接种3滴样本，每滴20μl，无需喷注，滴之间应避免接触；于室温下放置5min使其干燥；倒置平板，在35-37℃温度、微需氧条件下进行孵育；孵育24-72h之后，采用倒置显微镜（×10倍）对结果进行观察，Uu为黑色海胆样菌落，大小为10-50μm，若生长良好，菌落典型，则可判定为阳性。图2： Uu培养48H显微镜×10倍镜下形态

1.2.3  SAT法严格按照试剂盒说明书步骤进行包括①试剂准备②准备对照品③样品处理④核酸提取⑤核酸扩增检测⑥结果判读：dt≤35的样本可判定为阳性；35＜dt＜40的样品建议重新检测，检测结果dt＜40的样本为阳性；dt无数值或者为40的样本为阴性。dt表示样本曲线与阈值线交点的横坐标读数。

1.2.4统计学分析

采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析。采用行×列表资料的x检验进行阳性检出率的比较。利用kappa检验评价三种检测方法结果的一致性，kappa值大于0.8为一致性极强，0.6~0.8为高度一致，0.4~0.6为中度一致，0.2~0.4为一致性较弱。P<0.05为差异有统计学意义^[3]。

2结果

2.1三种检测方法对解脲脲原体感染患者阳性检出结果对比

液体培养法：500例样本中男性103例，女性397例，阳性检出率48%，其中男性40例阳性率38.83%，女性200例阳性率50.38%。固体培养法：与液体培养法相同样本，阳性检出率28%，其中男性15例阳性率14.56%，女性125例阳性率31.49%。SAT法：500例样本中男性187例，女性313例，阳性检出率45%，其中男性,66例阳性率35.14%，女性159例阳性率50.80%。三种方法女性阳性检出率高于男性阳性检出率，三种方法检测Uu男女阳性率差异无统计学意义，（X2=0.8184，P>0.5），见表2。

表2 三种检测方法阳性率比较

2.2 同时进行三种检测方法检测的患者158例，同时检测阳性例数17例，阴性例数50例，总一致率42.41%。三种检测方法两两进行一致性检验如下：

2.2.1 从表3可见，液体培养法与SAT法检测阳性一致率84.51%，阴性一致率81.60%，总一致率82.91%，kappa一致性检验值0.66，高度一致。

表3 液体培养法与SAT法检测结果进行比较

2.2.2 从表4可见，液体培养法与固体法检测阳性一致率84.09%，阴性一致率65.78%，总一致率70.89%，kappa一致性检验值0.41，中度一致。

表4 液体培养法与固体培养法检测结果进行比较

2.2.3 从表5可见，SAT法与固体法检测阳性一致率86.36%，阴性一致率71.05%，总一致率75.32%，kappa一致性检验值0.48，中度一致。

表5  SAT法与固体培养法检测结果进行比较

2.3 药物敏感性检测

2.2 药物敏感性测试  对Uu液体培养法与SAT法检测阳性结果的60例样本进行药敏检测，结果显示Uu对10种药物敏感性依次为司帕沙星、强力霉素、交沙霉素、四环素、罗红霉素、克拉霉素、红霉素、阿齐霉素、氧氟沙星、环丙沙星。

3 讨论

从以上观察的数据来看，液体培养法检测Uu阳性率最高，SAT法次之，固体培养法最低，这与郑敬业^[4]、汪宇婴、陆学东^[5]研究一致。同期女性Uu阳性检出率明显高于男性Uu阳性检出率，这与徐丽玲^[6]、曲沛^[7]、胡雯^[8]研究结果相一致，原因是这可能与解脲脲原体的生物学特点以及不同性别解剖生理结构有关，解脲脲原体为细胞外寄生菌, 在泌尿道中极易被尿液冲洗掉, 而女性的解剖结构缺乏尿液冲洗力的作用，还有就是与女性生殖道的微环境(温度、湿度等)可能更适合解脲脲原体生存，解脲脲原体可能是女性生殖道正常菌群之一，大多数情况下女性泌尿生殖道解脲脲原体感染并不致病^[910]，部分女性无明显自觉症状, 主动就诊率低，发病才就诊有关。

三种检测方法同时进行样本检测的一致率为42.41%，两组间比较，液体培养法与SAT法检测结果高度一致，这与陶琪^[3]研究结果（kappa值0.4，一致性较弱）有所不同；液体培养法与固体培养法、SAT法与固体培养法检测Uu结果一致性具有中度一致性。

在三种检测方法中均出现结果不一致情况，分析可能的因素为：①液体培养法中样本中含有能分解尿素的细菌或者真菌其菌量超过培养基中抗生素的抑制能力致使液体培养法中培养基变红，出现假阳性^[11]；②液体培养法在培养过程中，样本中存在某些微生物抑制了UU的生长繁殖, 或在进化过程中UU发生突变, 不分解尿素, 没有使培养基颜色改变^[11]，也可能是Uu标本取样量不足，含量低及生长缓慢，未及时送检、及时接种检测，保存条件不当，取材前使用抗生素等因素影响等因素而造成假阴性；③SAT样本中存在扩增抑制物或样本保存不当造成RNA降解致使SAT检测出现假阴性^[11]；④Uu菌落在固体培养基上可在48 h内长出，菌落形态典型，不会出现假阳性，但会出现一些假阴性，可能原因是从液体培养基转种至固体培养基选择的时间不当，对Uu含量高的样本增殖高峰在6～12 h，而Uu含量低的标本，增殖的高峰在12～24 h。增菌时间过长会引起pH值升高，而Uu最适pH为6.0左右，致使Uu很快死亡出现假阴性^[12]。如果转种时间过短，小于10 h，可能没有在支原体的对数生长期，阳性率低^[13]。

一般基层医疗机构通常会采用液体培养法来检测Uu，该检测方法快速、简单而且包含药物敏感性测试，一般医疗机构都可以开展，但是容易误判导致假阳性或假阴性；固体培养法可采用显微镜直接观察到支原体的典型菌落而确证支原体的存在，该方法是检测解脲脲原体的金标准，无假阳性但是可能会出现假阴性致其漏检，其操作相对繁琐且对检测人员的经验技术要求较高，临床还未普及用应；SAT法是将新一代的核酸恒温扩增技术和实时荧光检测技术相结合的一种新型核酸检测技术，具有高特异性与灵敏度、反应稳定、低污染等优点^[14]，是目前比较热门的一个检测技术，有的基层医院也开始开展，但其无药物敏感性测试无法为临床药物治疗选择提供参考依据。

Uu的过渡治疗，不合理用药情况使得多重耐药性的Uu菌株不断增多，使得Uu感染久治不愈、病情反复，经验用药前提需了解本地区Uu药物敏感性，本实验研究出Uu感染敏感性最高前4种药物依次为司帕沙星、强力霉素、四环素、交沙霉素。

综上所述，每种检测方法各有优缺点，单用一种方法检测Uu容易造成误诊、漏诊，选择合适的检测方法显得对临床诊治十分必要。临床医师可以根据需求联合两种检测方法提高检测的准确性，为Uu的早发现、早诊断、早治疗提供坚实基础，避免漏诊及过渡治疗，从而减轻患者的经济和心理负担。

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基金项目：2022年东莞市社会发展科技项目面上项目

项目编号：20221800901262