妊娠剧吐是一种常见的影响孕妇及胎儿健康的疾病,表现为频繁的恶心呕吐、脱水、离子紊乱、体液失衡、代谢障碍等。目前已有报道中HG发病率最低为0.3%^[1],最高为10.8%^[2]，全球范围内的发病率约为0.3%～3.6%^[3]。而妊娠剧吐的发生机制目前尚不明确，临床上亦缺乏有效的治疗手段。随着精准医疗时代的到来，基因测序走进大众视野，使得肠道菌群分析技术日趋成熟。近年来有研究证实多种疾病的发生发展都与肠道微生态失衡相关，如肥胖、糖尿病、炎症性肠病、心血管疾病等^[4] ，但HG与肠道微生态变化的相关研究鲜少，本研究采用16S rDNA测序技术对HG孕妇的粪便菌群进行检测并进行生物信息分析，为妊娠剧吐的早期预防及治疗提供一定的理论支撑，继而指导临床实践，为母婴健康保驾护航。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象

采用前瞻性研究方法，收集2023年5月至2024年9月期间，妊娠4-16周于我院住院的11例HG孕妇为HG组，以同期就诊我院的13例健康妊娠孕妇作为对照组(NHG组)。2组研究对象的一般资料对比见表1，年龄、孕周、妊娠次数、孕前体质量指数（body mass index,BMI）差别无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。纳入标准：①B超确诊宫内孕孕妇，且为自然受孕、单胎妊娠；②年龄18-35周岁，妊娠4-16周；③长期居住在本地且近期饮食正常。④排除妊娠前有严重胃肠道疾病和引起肠道菌群失调的疾病包括息肉和癌症、感染、腹腔疾病、克罗恩病、溃疡性结肠炎、憩室炎、吸收不良、短肠综合征和肠缺血、胃食管反流病、消化系统溃疡病和食管裂孔疝者；⑤排除患有任何妊娠相关疾病如妊娠期糖尿病、妊娠期高血压及先兆子痫者。⑥排除近期患有上呼吸道感染、肠胃炎及其他炎性相关疾病。⑦HG的诊断参照美国妇产科医师学会“妊娠期恶心呕吐指南 2018 版”^[5]所指出的：不能被其他疾病解释的持续性呕吐，急性饥饿指标呈阳性(通常为尿酮体阳性)，体质量下降超过孕前体质量的5%以上，可能伴有电解质、甲状腺功能和肝脏功能等的异常。

本研究经医院伦理委员会审批通过，所有研究对象均签署知情同意书。

表1 一般资料对比

1.1.2 样本采集

符合入组标准的孕妇由医务人员分发无菌大便采集管，HG孕妇粪便样本采集均在临床治疗前，采集晨起第一次排便时的样本，２小时内置于-80°Ｃ冰箱保存，填好送样单信息，干冰寄送

1.2 方法

1.2.1 样品DNA抽提

对HG组和NHG组的粪便样本根据FastPure Stool DNA Isolation Kit (MJYH, shanghai, China)说明书进行微生物群落总基因组DNA抽提。

1.2.2 PCR扩增和测序文库构建

分别提取不同菌源的DNA，用含有Barcode序列的上游引物338F(5’-ACTCC

TACGGGAGGCAGCAG-3’)和下游引物806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTA

AT-3’)^[6]对16SrRNA基因的V3-V4变异区片段进行PCR扩增。PCR条件：95℃预变性3min，72℃延伸稳定10min，4℃保存。PCR产物以2%琼脂糖凝胶回收，用Qubit4.0(QIAGEN，USA)对产物进行定量。纯化后的PCR产物用NEXTFLEX

RapidDNA-SeqKit构建文库，以IlluminaNextseq2000进行测序。测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.2.3 高通量测序数据分析

采用fastp^[7]0.19.6版本软件对双端原始测序序列进行质控，然后通过FLASH^[8]1.2.11版本软件进行序列拼接。接着，利用UPARSE v7.1软件^[8,9]对经过质量控制和拼接的序列进行操作分类单元（OTU）的聚类分析，并去除嵌合体。最终使用RDP classifier^[10]（version 2.11）对基因数据库进行比对，以完成OTU物种的分类注释，设定置信度为70%，并在不同物种分类水平下统计每个样本的群落组成

1.2.4 统计分析

采用SPSS27.0软件，对计量资料进行正态性检验，符合正态分布的计量资料以X±S表示，并采用独立样本ｔ检验进行组间比较；另通过美吉生物云平台（https://cloud.majorbio.com），使用基于bray-curtis距离算法的PCoA分析检验样本间微生物群落结构的相似性，并结合PERMANOVA非参数检验分析样本组间微生物群落结构差异是否显著，用Wilcoxon秩和检验比较组间属水平菌群相对丰度差异，统计学检验以P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 肠道菌群β多样性分析 就PCoA结果显示，妊娠剧吐组与正常妊娠组样本分离，前两个主轴能有效解释总变异，解释率分别为20.54％（PC1）和15.84％（PC2）（P=0.002）。NMDS分析显示，HG组与NHG组间菌群组成差别有统计学意义（P=0.002)。结合PERMANOVA非参数检验分析可知样本组间微生物群落结构在属水平（P=0.01）及种水平（P=0.014）差异显著。（图1，表2）

图1 HG组与正常对照组β多样性比较

表2 PERMANOVA非参数检验分析HG与NHG组间微生物群落结构差异

2.2 属水平差异菌分析

属水平菌群组成分析可看出，相较于对照组，HG组孕妇肠道微生物中哈特韦氏菌属（Hungattella）(P=0.002)、副普雷沃氏菌属（Paraprevoyella）(P=0.045)、丹毒梭菌属（Erysipelatoclostridium）（P=0.044）、UBA1819(P=0.042)等丰度高，而粪杆菌属（Feacalibacterium）（P=0.049）、琼脂杆菌属（Agathobacter）（P=0.001）、梭形杆菌属（Fusicatenibacter）（P=0.008）、罗姆布次菌属（Romboutsia）(P=0.006）、Eubacterium-ventriosum-Group(P=0.045)、Lachnospiraceae-NC2004-group（P=0.020）、Ruminococcus-gauvreauii-group(P=0.002)、、毛螺菌属（Lachnospira）（P=0.011）等丰度降低。（图2）。

图2 HG组与NHG组肠道菌群属水平差异

3. 讨论

肠道微生物群是人体重要的组成部分，正常的肠道微生态在维持机体代谢、营养、抗菌及维护肠黏膜与免疫调节中起关键作用^[11]，而肠道菌群失衡与多种临床疾病相关，有望成为治疗干预的靶点^[12]。肠道细菌过度生长或者易位等所致的微生物群落的数量或结构发生改变，从而破坏机体内在和外界环境的稳态的一种病理状态，即肠道菌群失衡，会诱发或加重疾病，不同程度上危害机体健康^[13-16]。

本研究应用16S-rDNA扩增子高通量测序技术对HG孕妇的肠道菌群进行研究，其中β多样性结果提示，HG剧吐孕妇肠道菌属组成与正常妊娠孕妇有显著差异（图3），表现为粪杆菌属、琼脂杆菌属、梭形杆菌属、罗姆布次菌属、Eubacterium-ventriosum-Group、Ruminococcus-gauvreauii-group、Lachnospiraceae-NC2004-group、毛螺菌属等优势菌属微生物含量减少，而哈特韦氏菌属、丹毒梭菌属等微生物丰度显著增加（图2）。

短链脂肪酸（SCFAs）是由肠道微生物群如罗姆布次菌属、粪杆菌属、琼脂杆菌属等发酵膳食纤维产生的代谢产物，在抑制肠道和其他器官炎症和癌变中起到重要保护作用，同时也体现了机体代谢产生的营养及能量水平^[17-20]。因此妊娠剧吐孕妇肠道罗姆布次菌属、粪杆菌属、琼脂杆菌属等微生物群减少，可能影响孕妇自身抗炎反应。SCFAs主要包括乙酸、丙酸和丁酸，其中丁酸虽然含量较少，但对肠道健康有重要作用。而粪杆菌属、Eubacterium-ventriosum-Group、Ruminococcus-gauvreauii-group、Lachnospiraceae-NC2004-group等均属产丁酸菌^[21-23]。Feng等^［24］人的研究中指出，丁酸能通过抑制Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体和自噬来促进肠黏膜屏障的形成，防止脂多糖对屏障的破坏。丁酸也可通过激活肠上皮细胞的缺氧诱导因子-1(HIF-1)减轻肠道炎症反应，使其免受内毒素的侵害^[25]。相反的，Sheikh等^[26]人通过将炎症性肠病患者的粪便微生物移植观察无菌小鼠结肠黏膜中的自发性炎症变化，确定了丹毒梭菌属是能够促进炎症发生的致病性微生物群落。He J等^[27]人的研究指出便秘型自闭症患儿肠道富集丹毒梭菌属。Cai等人^[28]发现肠道细菌丹毒梭菌可能是辐射诱导的肠道损伤的可能病原体。

综上所述，HG孕妇与正常妊娠孕妇肠道菌群在属水平差异显著，表现为粪杆菌属、琼脂杆菌属、梭形杆菌属、罗姆布次菌属、Ruminococcus-gauvreauii-group等抗炎有益共生菌属丰度降低，而致炎病原菌属丹毒梭菌属丰度显著增加。但本研究样本量相对较少，之后的研究中可充分增加样本量，从而探索妊娠剧吐-机体免疫及炎症反应-肠道菌群失衡之间的作用机制，并尝试从膳食着手，挖掘饮食结构之于妊娠剧吐发生发展的关系，为妊娠剧吐的预防和治疗提供理论支撑。

参考文献

[1]M Erick，JT Cox，KM Mogensen．etal．ACOG Practice Bulletin 189: Nausea and vomiting of pregnancy［J］．Obstet- rics and Gynecology，2018，131( 1) : e15 － e16．

[2]Zhang J, Cai WW. Severe vomiting during pregnancy: antenatal correlates and fetal outcomes. Epidemiology. 1991;2(6):454-457.

[3]Einarson TR, Piwko C, Koren G. Quantifying the global rates of nausea and vomiting of pregnancy: a meta analysis. J Popul Ther Clin Pharmacol. 2013;20(2):e171-e183.

[4]Fu Q, Song T, Ma X, Cui J. Research progress on the relationship between intestinal microecology and intestinal bowel disease. Animal Model Exp Med. 2022;5(4):297-310.

[5]Committee on Practice Bulletins-Obstetrics. ACOG Practice Bulletin No. 189: Nausea And Vomiting Of Pregnancy. Obstet Gynecol. 2018;131(1):e15-e30.

[6] Liu C, Zhao D, Ma W, et al. Denitrifying sulfide removal process on high-salinity wastewaters in the presence of Halomonas sp[J]. Applied microbiology and biotechnology, 2016, 100(3): 1421-1426.

[7]Chen S ,  Zhou Y ,  Chen Y , et al. fastp: an ultra-fast all-in-one FASTQ preprocessor[J]. Bioinformatics, 2018, 34(17):i884-i890.

[8] Tanja, Mago, Steven, et al. FLASH: fast length adjustment of short reads to improve genome assemblies.[J]. Bioinformatics, 2011, 27(21):2957‐2963.

[9] Edgar, Robert C . UPARSE: highly accurate OTU sequences from microbial amplicon reads.[J]. Nature Methods, 2013, 10(10):996‐998.

[10] Stackebrandt E , Goebel B M . Taxonomic Note: A Place for DNA-DNA Reassociation and 16S rRNA Sequence Analysis in the Present Species Definition in Bacteriology[J].Int.j.syst.bacteriol,1994,44(4):846-849.

[11]SEBASTIAN D J J，SANCHEZ S C. From the intestinal flora to the microbiome[J]. Rev Esp Enferm Dig,2018,110(1):51-56.

[12]TANES C , BITTINGER K , GAO Y , et al. Role of dietary fiber in the recovery of the  human gut microbiome and its metabolome[J] . Cell Host Microbe , 2021 , 29(3) :394-407.

[13]SHI N，LIN，DUAN X W，et al. Interaction between the gut microbiome and mucosal immune system［J］.Mil Med Res,2017,4(3):170-177.

[14]Wang Y, Li Y, Bo L, et al. Progress of linking gut microbiota and musculoskeletal health: casualty, mechanisms, and translational values. Gut Microbes. 2023;15(2):2263207.

[15] Zhang Z, Lin T, Meng Y, et al. FOS/GOS attenuates high-fat diet induced bone loss via reversing microbiota dysbiosis, high intestinal permeability and systemic inflammation in mice. Metabolism. 2021;119:154767.

[16]Jia M, Yi B, Chen X, et al. Carbon dots induce pathological damage to the intestine via causing intestinal flora dysbiosis and intestinal inflammation. J Nanobiotechnology. 2023;21(1):167. Published 2023 May 25.

[17]Kashyap PC, Marcobal A, Ursell LK, et al. Complex interactions among diet, gastrointestinal transit, and gut microbiota in humanized mice. Gastroenterology. 2013;144(5):967-977.

[18]Sivaprakasam S, Prasad PD, Singh N. Benefits of short-chain fatty acids and their receptors in inflammation and carcinogenesis. Pharmacol Ther. 2016;164:144-151.

[19]Pituch A, Walkowiak J, Banaszkiewicz A. Butyric acid in functional constipation. Prz Gastroenterol. 2013;8(5):295-298.

[20]Rodríguez-García A, Arroyo A, García-Vicente R, et al. Short-Chain Fatty Acid Production by Gut Microbiota Predicts Treatment Response in Multiple Myeloma. Clin Cancer Res. 2024;30(4):904-917.

[21]Deng M, Wu X, Duan X, et al. Lactobacillus paracasei L9 improves colitis by expanding butyrate-producing bacteria that inhibit the IL-6/STAT3 signaling pathway. Food Funct. 2021;12(21):10700-10713. Published 2021 Nov 1.

[22]许真源,李小雅,许雅青,等.产丁酸菌调节肠道微生态及中药的干预作用研究进展[J].中国实验方剂学杂志,2020,26(06):226-233.

[23]Zhuang M, Shang W, Ma Q, Strappe P, Zhou Z. Abundance of Probiotics and Butyrate-Production Microbiome Manages Constipation via Short-Chain Fatty Acids Production and Hormones Secretion. Mol Nutr Food Res. 2019;63(23):e1801187.

[24]Feng Y, Wang Y, Wang P, Huang Y, Wang F. Short-Chain Fatty Acids Manifest Stimulative and Protective Effects on Intestinal Barrier Function Through the Inhibition of NLRP3 Inflammasome and Autophagy. Cell Physiol Biochem. 2018;49(1):190-205.

[25]Fachi JL, Felipe JS, Pral LP, et al. Butyrate Protects Mice from Clostridium difficile-Induced Colitis through an HIF-1-Dependent Mechanism. Cell Rep. 2019;27(3):750-761.e7.

[26]Sheikh IA, Bianchi-Smak J, Laubitz D, et al. Transplant of microbiota from Crohn's disease patients to germ-free mice results in colitis. Gut Microbes. 2024;16(1):2333483.

[27]He J, Gong X, Hu B, et al. Altered Gut Microbiota and Short-chain Fatty Acids in Chinese Children with Constipated Autism Spectrum Disorder. Sci Rep. 2023;13(1):19103. Published 2023 Nov 4.

[28]Cai S, Yang Y, Kong Y, et al. Gut Bacteria Erysipelatoclostridium and Its Related Metabolite Ptilosteroid A Could Predict Radiation-Induced Intestinal Injury. Front Public Health. 2022;10:862598. Published 2022 Mar 28.