0引言

类风湿关节炎（RA）是一种自身免疫性疾病，其主要病理特征为持续性关节滑膜炎症和侵袭性血管翳形成，随着病情的进展，出现骨和软骨的破坏，最终导致畸形甚至引起残疾^[1]。该病在藏医中属于托拉病的范畴， 主要是由于起居不当， 饮食不规律导致希热乌苏淤积骨关节而引起的关节炎疾病^[2]。而西藏是我国RA的高发区。流行病学研究发现，西藏地区RA的发病率高达25%^[3]，远远高于全国平均水平（0.34%—0.36% ）^[4]，已成为威胁西藏地区人群健康的重要疾病之一。由于它的主要临床表现是关节僵硬、畸形、僵硬，甚至关节脱位；导致RA的残疾率非常高。西药传统治疗RA的主要处方药包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、糖皮质激素（GCs）、改变疾病的抗风湿药物和靶向生物制剂。然而，由于RA的发病机制复杂，这些药物未能产生令人满意的药理作用，同时也会产生严重的副作用，包括免疫缺陷、胃肠道疾病和体液疾病等。

二十五味儿茶丸是藏医传统药方，具有祛风除瘦，消炎止痛，干黄水的功效。用于“白脉”病，痛风，风湿性关节炎，关节肿痛变形，四肢僵硬，黄水病，“同巴”病等，收载于《中华人民共和国卫生部药品标准》藏药（第一册）^[5]。其主要由儿茶、西藏棱子芹、黄精、天冬、喜马拉雅紫茉莉、蒺藜、乳香、决明子、黄葵子、宽筋藤、麝香、铁棒锤等二十五味中藏药组成^[6]。

类风湿性关节炎在藏医属于“真布病”范畴。根据藏医“三因（隆、赤巴、培根）”学说，“真布病”是一种由“隆、培根”功能紊乱而引起的一种以关节肿痛，“黄水”聚积等为特征的病理学变化。二十五味儿茶丸则通过“一通、二补、三平衡、四清除”达到对风湿免疫性疾病的治疗效果^[7]。截至目前，使用传统的藏医药方二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎， 取得了比较满意的治疗效果^[2]。且研究表明，二十五味儿茶丸是由藏药配制而成，服用后不会出现西药患者容易出现的胃溃疡、消化不良等不良反应。因此，二十五味儿茶丸对治疗类风湿性关节炎具有很高的应用价值，值得临床推广应用^[8]。

但由于二十五味儿茶丸的化学成分复杂，始终无法获取其准确的活性药味。本研究则将通过网络药理学的研究方法，探究二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎的关键药味及可能的作用机制。

1数据来源及研究方法

1.1二十五味儿茶丸的化学成分收集及靶点预测

使用中药系统药理学据库分析平台（TraditionalChineseMedicineDatabaseandAnalysisPlatform,TCMSP,https://tcmsp-e.com/）以口服生物利用度（oralbioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18为条件，检索儿茶、西藏棱子芹、黄精、天冬、喜马拉雅紫茉莉、蒺藜、乳香、决明子、黄葵子、宽筋藤、麝香、铁棒锤、荜茇、木香、诃子的所有活性成分，进行筛选得到活性成分。通过登录BATMAN-TCM数据库（http://bionet.ncpsb.org.cn/batman-tcm/）获得麝香可信度高的蛋白作为候选基因。删除无效重复靶点。将未在两个数据库检索到藏药成分，通过中国知网检索有效成分，并通过SwissTargetprediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）检索成分对应的靶点。将整理得到的靶点经Uniprot（https://www.uniprot.org/）数据校准后，剔除非人源基因，删除无效重复靶点，得到标准化的基因名。

1.2类风湿性关节炎相关靶点的获取

通过在GeneCards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://www.omim.org/）数据库中输入关键词“rheumatoid arthritis”进行检索，从而得到与疾病相关靶点，将数据库所有靶点整合在excle中，剔除重复基因，并经Uniprot数据库进行校正，得到疾病靶点基因信息。

1.3药物－疾病靶点预测结果

将获得的药物成分靶点与疾病靶点相互映射，然后作Venn图，从而获得交集基因。然后使用Cytoscape3.7.2软件构建“药物－成分－作用靶点”网络。

1.4靶蛋白相互作用网络构建

为了进一步研究二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎的蛋白与蛋白之间的相互作用，将药物－交集基因上传至相互作用数据库String（https://string-db.org/）进行蛋白相互作用网络构建（PPI）数据库；物种设置为“Homosapiens”，最低相互作用评分设置为0.9，确保本研究的可信度，其余参数保持默认设置，结果储存为TSV格式，将TSV文件导入Cytoscape3.7.2中，并对网络进行分析（Cytoscape→Tools→Networkanalyzer→Networkanalysis→Analyzenetwork)，保存网络分析结果，用节点大小和颜色反应反映Degree的大小，节点越大Degree值越大；边的粗细用于反映Combinescore的大小，边越粗Combinescore越大，挑选核心的靶点做出蛋白相互作用网络图。

1.5GO富集分析和KEGG通路分析

将药物－疾病交集基因上传至DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），基因标识符选择OFFICIAL_GENE_SYMBOL，物种设置为：HomoSapiens。利用DAVID6.8GO基因功能从生物过程（BiologicalProcess,BP）、细胞成分（CellularComponent,CC）、分子功能（MolecularFunction,MF）三方面注释二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎的作用靶蛋白在基因功能中的作用。为阐明二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎的靶点在信号通路中进行KEGG通路富集分析。选取GO功能中BP，CC，MF排名前10条，KEGG通路条目与类风湿性关节炎有关的20条通路（P<0.01）作为二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎的主要基因功能富集过程和信号通路，预测二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎的作用机制。

2研究结果

2.1二十五味儿茶丸活性成分及靶点预测

通过TCMSP检索，以OB≥30%，DL≥0.18并剔除无效成分后，筛选收集到儿茶11个成分、黄精9个成分、天冬9个成分、蒺藜12个成分、乳香8个成分、决明子13个成分、荜茇13个成分、木香5个成分、诃子7个成分。麝香通过BATMAN-TCM数 据 库，在Score cutoff＞0.99（LR=1626）、P＜0.05条件下，得到麝香16个成分。黄葵子、宽筋藤、铁棒锤、西藏棱子芹、喜马拉雅紫茉莉通过中国知网检索到黄葵子6个成分、宽筋藤6个成分、铁棒锤6个成分、西藏棱子芹10个成分、喜马拉雅紫茉莉2个成分。

2.2类风湿性关节炎相关靶点

通过GeneCards、OMIM数据库分别获得5961、42个靶点，去重后获得5990与类风湿性关节炎相关的靶点，将得到的基因经Uniprot数据库校正。将药物的作用靶点与类风湿性关节炎的靶点基因取交集后，获得564个类风湿性关节炎与药物的交集靶点基因，为药物治疗类风湿性关节炎的交互靶点基因。

2.3药物－成分－靶点预测结果

利用药物－成分－靶点数据，构建“network.xlsx”文件以及“type.xlsx”文件，将文件导入Cytoscape3.7.2进行作图，包括684个节点和2163条边。Degree值较高的成分包括quercetin、kaemferol、Estradiol、Azelaic Acid、Pregnenolone。

2.4核心靶点及网络相互作用

将所有药物的作用靶点与类风湿性关节炎的靶点基因取交集后，获得564个类风湿性关节炎与药物的交集靶点基因，为药物治疗类风湿性关节炎的交互靶点基因。将得到的564个交集靶点基因导入String（https://string-db.org/）数据库中进行蛋白－蛋白相互作用预测，物种设置为：HomoSapiens，置信度设置为：0.9。将网络文件保存为TSV格式，将TSV文件导入Cytoscape3.7.2软件绘制蛋白相互作用网络，选择Degree值＞14，图中包括106个节点和2020条边。对网络进行拓扑分析，以degree值反映靶点大小及颜色，以combinedscore值反映边的粗细，从而构建蛋白－蛋白相互作用网络，如图所示。其中TP53、AKT1STAT3、SRC、HSP90AA1、JUN、EGFR、EP300、ESR1、PIK3CA为核心靶点。

2.5生物功能富集分析

2.5.1GO富集分析

取药物－疾病交集基因，利用DAVID数据库进行GO基因功能富集分析，共筛选出1272条GO条目，以P＜0.01作为标准筛选二十五味儿茶治疗类风湿性关节炎的显著富集的生物功能主要条目968条，见图，主要为信号转导、凋亡过程的负调控、炎症反应、基因表达的正调控、细胞增殖的正向调节、蛋白质磷酸化、对外源性刺激的反应、凋亡过程、G蛋白偶联受体信号通路、细胞迁移的正向调节；细胞成分（CC）相关的有106条，涉及质膜、细胞质溶胶、细胞质、核、膜的组成部分、核原形质核浆、膜、胞外区、细胞外间隙、胞外外泌体；其中分子功能相关的有198条，涉及蛋白质结合、相同的蛋白结合、ATP结合、酶结合、蛋白激酶活性、蛋白质同二聚化活性、DNA结合、锌离子结合、蛋白激酶结合、大分子复合物结合。

2.5.2KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库进行通路富集分析，共富集到207条与二十五味儿茶治疗类风湿性关节炎相关的通路，根据P＜0.01筛选出二十五味儿茶与治疗类风湿性关节炎的通路176条，筛选出与类风湿性关节炎相关的通路，分别是：内分泌抗性、FOXO信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、HIF-1信号通路、RAS信号通路、松弛素信号通路、IL-17信号通路、趋化因子信号通路、鞘脂信号通路、ErbB信号通路、VEGF信号通路、CAMP信号通路、JAK-STAT信号通路、Rap1信号通路、NF-κB信号通路、p53信号通路。

3讨论

综上所述，本文利用网络药理学的方法，筛选出核心靶点9个，主要涉及：TP53、AKT1STAT3、SRC、HSP90AA1、JUN、EGFR、EP300、ESR1、PIK3CA；相关通路20条，主要涉及内分泌抗性、FOXO信号通路、PI3K-Akt信号通路、MAPK信号通路、Toll样受体信号通路、Th17细胞分化、TNF信号通路、HIF-1信号通路、RAS信号通路、松弛素信号通路、IL-17信号通路、趋化因子信号通路、鞘脂信号通路、ErbB信号通路、VEGF信号通路、CAMP信号通路、JAK-STAT信号通路、Rap1信号通路、NF-κB信号通路、p53信号通路。本研究表明，二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎是多成分、多靶点、多通路共同协作的结果。本文的研究为后续阐明二十五味儿茶丸治疗类风湿性关节炎的具体作用机制提供了思路与相应的依据。也有助于二十五味儿茶丸的进一步研究开发，为寻找其作用机制奠定了一定基础，也为其他传统藏药的研发也可以提供参考。

参考文献

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