1.资料与方法

1.1病例来源

本次研究依据2022年6月至2023年6月期间开展的一项脑膜炎奈瑟菌疫苗临床试验前期筛查工作，研究对象为本市招募的6至24月龄健康婴幼儿，共计375名，所有对象均由家长签署书面知情同意书后纳入调查，纳入标准要求所有婴幼儿无该疾病免疫史，近期未使用抗生素、无发热或呼吸道感染症状，且既往无免疫系统疾病病史。

1.2样本采集与保存方法

所有咽拭子采样操作由统一接受培训的医护人员完成，确保采样操作规范、一致，使用无菌咽拭子从受试者咽后壁及双侧扁桃体区域反复擦拭3至5次，采集黏膜表面的微生物。样本采集后立即分为两部分，一份置于含有5 mL增菌液的管中备用，增菌液以胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）为基础，加入0.5%酵母提取物及VCNT抑菌剂；另一份则加入DNA保存液后，于–80°C条件下冷冻保存，用于后续分子检测。

1.3增菌培养法的检测流程

用于培养的咽拭子样本先在37°C、5% CO₂条件下振荡孵育4小时以促进细菌生长，然后接种于添加VCNT抑菌剂的巧克力琼脂平板上，继续培养24至48小时。对于培养出的透明小菌落，初步判断为可能的脑膜炎奈瑟菌后，进一步采用氧化酶试验和VITEK-2全自动微生物鉴定系统进行鉴定，最终确认为Neisseria meningitidis者，记录为培养阳性。

1.4直接PCR法的检测流程

保存于–80°C的样本用于提取总DNA，采用磁珠法提取试剂盒（Tiangen Biotech, China），按照说明书标准操作流程进行。PCR扩增靶点为脑膜炎奈瑟菌特异性基因，包括ctrA（编码胶囊转运相关蛋白）和sodC（编码超氧化物歧化酶）。扩增体系体积为25 μL，包含2×反应缓冲液、上下游引物（0.5 μmol/L）、探针、Taq酶及模板DNA。扩增程序为95°C预变性3分钟，之后40个循环，每循环95°C 15秒、60°C 60秒。将Ct值小于35定义为阳性。

1.5 数据处理与统计方法

实验数据整理录入Excel 2021，统计分析使用SPSS 26.0软件完成，计数数据以频数和百分比表示，不同检测方法之间的差异采用χ²检验进行比较；对于增菌培养法与PCR法之间检测结果的一致性，通过Kappa系数（κ）进行分析；κ值小于0.40表示一致性差，0.40至0.75表示中等一致性，大于0.75则为一致性良好，P<0.05被认为具有统计学意义。

2.结果评价

2.1两种检测方法对脑膜炎奈瑟菌检出情况

直接PCR法在本研究中检出率为10.1%，显著高于增菌培养法的5.6%，差异具有统计学意义（χ²=6.73，P=0.009）。详见表1。

表1两种检测方法对脑膜炎奈瑟菌检出情况（n=375）

2.2两种方法检测结果一致性分析

两种方法的阳性结果一致性为12例，Kappa系数为0.41，表明两法一致性处于中等水平，PCR阳性中有较大比例未被培养法检出，提示两法存在一定互补性，联合使用可提升携带者识别的准确性。

表2两种方法检测结果一致性分析（n=375）

3.讨论

流行性脑膜炎，医学上称为流行性脑脊髓膜炎，俗称“流脑”，是一种由脑膜炎奈瑟菌经呼吸道传播引起的急性传染性疾病^[1]。该病发作迅猛，传播速度快，病死率高，若未能及时识别和干预，可能迅速进展为败血症性休克或中枢神经系统损害，严重威胁患者生命安全。临床上，患者常表现为发热、头痛、呕吐和皮肤瘀点等症状，一旦错失治疗时机，极易引发多系统并发症，甚至导致死亡^[2]。脑膜炎奈瑟菌广泛存在于健康人群的咽部，是一种常见的无症状定植菌。在多数情况下，它并不引起明显症状，但对于免疫系统尚未成熟的婴幼儿而言，一旦菌体穿透黏膜屏障，极易诱发严重感染^[3]。基于此背景，在该人群中准确识别奈瑟菌携带者，对于疾病防控、疫苗接种前的风险评估以及公共卫生决策具有重要意义。

目前临床常用的增菌培养法在检测脑膜炎奈瑟菌方面具有一定优势，尤其是在获得活菌、开展血清分型及耐药性分析等方面具有不可替代的作用，这种方法能够为后续的流行病学追踪和疫苗株匹配提供直接证据。但在实际应用过程中，其灵敏度受多种因素影响，如样本转运的时效性、培养基的质量、菌群共生干扰以及菌体活性波动等，都可能导致假阴性结果，进而低估实际携带率。

在本研究中，375份婴幼儿咽拭子样本通过两种方法进行检测，结果显示：增菌培养法的阳性检出率为5.6%，而直接PCR法的检出率为10.1%。两者差异明显，说明直接PCR检测具有更高的灵敏性。PCR检测方法通过靶向特异性基因序列，即使在菌体数量较低或活性下降的情况下仍具良好识别能力，更适合婴幼儿低载量样本的快速检测。由于PCR检测操作简便、周期短，特别适合用于疫苗研究或流行病学调查中的高通量初筛。

由于PCR方法无法提供活菌信息，不能用于血清型分型和耐药分析，且可能因死菌残留DNA或序列相似物种而出现假阳性，另外研究中观察到两种方法的阳性结果并不完全一致，Kappa系数为0.41，说明两者一致性有限，但存在一定互补关系^[4]。部分样本只能被其中一种方法识别，表明二者侧重点不同。将两种技术联合使用，既可提升总检出率，又可保证对阳性样本的多层面分析，为后续研究提供更全面的数据支持^[5]。

本研究还对不同年龄段的携带情况进行了初步探讨，数据显示，13–24月龄组的携带率略高于6–12月龄组，虽无统计学意义，但提示随着月龄增长，携带风险可能增加。这一趋势可能与托育机构接触频率增加、呼吸道感染机会上升等因素相关，提示在制定疫苗接种策略时，干预窗口可适当前移，性别分析未发现携带率差异，表明性别可能不是影响定植的主要因素^[6]。

以上研究结果综合表明，直接PCR法在婴幼儿人群脑膜炎奈瑟菌携带筛查中具备更高的检测敏感性，可作为疫苗临床研究前的有效初筛工具；增菌培养法虽灵敏度略低，但在后续细菌学分析中的作用依然重要，将两者结合使用，有助于提高整体检测覆盖度，完善携带率评估体系，为疫苗效力验证及流行病防控措施的制定提供更可靠依据。

参考文献

[1] 陈银,葛以跃,赵康辰,等.环介导等温扩增结合核酸级联侵入反应和纳米金探针显色技术快速检测脑膜炎奈瑟菌[J].江苏预防医学,2018,29(06):607-610.

[2] 张丽芝,白贵杰,杨英英,等.多重PCR法用于脑膜炎奈瑟菌血清群分群鉴定的适用性[J].中国生物制品学杂志,2020,33(12):1414-1420.

[3] 哈力木别克·那扎尔别克,符文慧,兰兆国,等.脑膜炎奈瑟菌转运培养基保存效果评价[J].热带医学杂志,2025,25(03):315-318.

[4] 李江姣,刘茹凤,李康,等.脑膜炎奈瑟菌核酸检测试剂国家参考品的研制[J].中国医药生物技术,2022,17(03):268-270.

[5] 张丽芝,白贵杰,杨英英,等.多重PCR法用于脑膜炎奈瑟菌血清群分群鉴定的适用性[J].中国生物制品学杂志,2020,33(12):1414-1420.

[6] 郭玉婷,丁亚兴,骆晓艳,等.2017-2018年和2020年天津市健康人群A、C、W135和Y群脑膜炎奈瑟菌抗体水平监测[J].中国疫苗和免疫,2022,28(03):288-292.