系统性慢性炎症（systemic chronic inflammation，SCI）是一类以长期持续的炎症反应为特征的疾病，病程持续数月甚至数年，影响关节、肌肉等多系统等^[3]。SCI不仅使患者感到身体不适和疼痛严重影响生活质量，还对医疗系统造成沉重负担。SCI病理机制涉及免疫系统的异常激活、炎症介质的释放、组织损伤与修复等，但具体机制尚未完全明确。

髓系细胞触发受体-1（Triggering receptor expressed on myeloid cells-1,TREM-1）表达在天然免疫细胞表面，诱导产生TNF-α、IL-6等炎症介质，激活募集免疫细胞至炎症部位^[10]。我们前期研究发现TREM-1活化是慢性炎症疾病的独立危险因素，但TREM-1在慢性炎症中的表达及作用目前尚不清楚，本研究以LPS腹腔多次注射的小鼠作为慢性炎症动物模型，观察TREM-1在慢性炎症动物模型中的表达，sTREM-1蛋白预处理小鼠，LP17抑制TREM-1表达，测定炎症表达，探讨TREM-1是否参与慢性炎症的病理过程。

1.材料与方法

1.1主要试剂SPF级C57BL/6雄性小鼠（购买自杭州派思奥生物科技有限公司），脂多糖（LPS，美国sigma公司），MCC950（上海麦克林生化科技股份有限公司），LP17及NC对照蛋白（南京金斯瑞生物科技有限公司），小鼠IL-1βELSIA试剂盒、小鼠IL-6 ELSIA试剂盒、小鼠IL-18 ELSIA试剂盒、小鼠sTREM-1 ELSIA试剂盒及小鼠TNF-αELSIA试剂盒（加拿大，R&D公司），兔抗鼠Ly-6C-PE流式抗体及兔抗鼠CD11b-FITC流式抗体（美国，BD公司），抗小鼠TREM-1-Efflulor 660流式直标抗体（美国，赛默飞公司），兔抗鼠NLRP3多克隆抗体、兔抗鼠caspase-1单克隆抗体（武汉赛维尔生物科技有限公司），重组人sTREM-1蛋白及重组小鼠sTREM-1蛋白（中国，近岸公司），兔抗人NLRP1多克隆抗体、兔抗人AIM2多克隆抗体、兔抗人NLRP3多克隆抗体及兔抗人GAPDH多克隆抗体（美国，Cell Signaling Technology公司）。

1.2动物模型制备及实验分组

1.2.1 SCI模型：8-12周C57BL/6雄性小鼠分为4组：

（1）生理盐水组小鼠按0.5ml/只腹腔注射0.9%氯化钠溶液（n=5）；（2）SCI组小鼠经腹腔注射LPS（2ug/只/次，2次/周，共12周）（n=5）；

（3）SCI+LP17组小鼠经腹腔注射LPS（2ug/只/次，2次/周，共12周），LPS注射第11周时，LP17（20mg/kg，1次/天）经腹腔注射，共注射14次（n=5）；

（4）SCI+NC组小鼠经腹腔注射LPS（2ug/只/次，2次/周，共12周），LPS注射第11周时，NC（20mg/kg，1次/天）经腹腔注射，共注射14次（n=5）。

1.2.2 sTREM-1蛋白预处理：8-12周C57BL/6雄性小鼠分组：

（1）生理盐水组小鼠按0.5ml/只腹腔注射0.9%氯化钠溶液（n=12）；

（2）LPS组小鼠腹腔注射1mg/kg LPS溶液0.5ml（n=3）；

（3）LPS组+sTREM-1蛋白预处理小鼠按250pg/ml（n=3），500pg/ml（n=3）及1000pg/ml（n=12）尾静脉注射预处理，半小时后腹腔注射1mg/kg LPS溶液0.5ml。

1.3体重变化率计算：开始建模为week 0，测得的重量为体重A，每周测体重一次，测得的重量为体重x，体重变化率=（体重x-体重A）/体重A*100%。

1.4异氟烷吸入麻醉后取小鼠外周血SCI模型构建最后1次LPS（2ug/只/次）腹腔注射6小时后，各组小鼠异氟烷0.41ml/min吸入麻醉后常规取血，一部分外周血静置离心分离血清，ELISA测定炎症因子表达，一部分外周血置于EDTA抗凝管中，取500ul全血进行流式细胞检测。

1.5 H&E观察小鼠肺组织损伤程度石蜡切片脱蜡至水：依次将切片放入二甲苯Ⅰ20min-二甲苯Ⅱ20min-无水乙醇Ⅰ5min-无水乙醇Ⅱ5min-75%酒精5min，自来水洗。苏木素染色：切片入苏木素染液染3-5min，自来水洗，分化液分化，自来水洗，返蓝液返蓝，流水冲洗。伊红染色：切片依次入85%、95%的梯度酒精脱水各5min，入伊红染液中染色5min。脱水封片：切片依次放入无水乙醇I 5min-无水乙醇II 5min-无水乙醇Ⅲ5min-二甲Ⅰ5min-二甲苯Ⅱ5min透明，中性树胶封片。

1.6肺组织损伤评分：从（1）局灶性肺泡膜增厚；（2）毛细血管充血；（3）肺泡内出血；（4）间质内白细胞浸润；（5）肺泡内白细胞浸润；（6）水肿六个维度进行评分，每个维度按：无（0分），轻度（1分），中度（2分）及重度（3分）进行打分，六个维度的总分为肺组织损伤的评分。

1.7流式测定小鼠外周血TREM-1的表达具体参照试剂操作说明书，外周血细胞经lysing buffer作用后，加入兔抗鼠Ly-6C-PE流式抗体、兔抗鼠CD11b-FITC流式抗体及抗小鼠TREM-1-Efflulor 660流式抗体4℃避光30min，离心后200ul Stain Buffer重悬细胞后上机检测。

1.8 ELISA测定小鼠外周血炎症表达水平按试剂操作说明，capture antibody25℃孵育过夜，封闭液25℃封闭1小时，待测血清25ul，detection antibody25℃作用2小时，HRP酶溶液25℃1小时，加入底物终止液充分混匀后在30 min内，在酶标仪上检测各孔在450 nm和540 nm的吸光度值，根据标准曲线计算相应细胞因子浓度。

1.9免疫组化观察小鼠肺组织中caspase-1及NLRP3信号通路分子的表达石蜡切片脱蜡、抗原修复、阻断內源性过氧化物酶，3%BSA室温封闭30分钟，加入一抗（兔抗鼠caspase-1单克隆抗体稀释比1:1000；兔抗鼠NLRP3多克隆抗体稀释比1:300）4°C孵育过夜，二抗室温孵育50分钟，DAB显色，苏木素复染，脱水封片后镜检。

1.10统计学方法采用SPSS 25.0统计软件。数据以平均值(标准差)、数字(百分比)或中位数(四分位数范围)表示，各组间比较采用单因素方差分析，以p<0.05为差异有统计学意义。

2.结果

2.1 SCI模型小鼠体重增加率下降，炎症因子表达增高，肺组织损伤严重

与生理盐水组相比，SCI小鼠体重增加率从第1周起明显下降（P<0.01）；SCI小鼠肺泡间隔增厚、肺泡中单核细胞浸润增加，肺损伤评分升高（2.40 vs 10.40，P<0.0001）；SCI小鼠血清中IL-1β（3.37 vs 51.93 pg/ml，P<0.001），IL-18（8.64 vs 121.30 pg/ml，P<0.0001），TNF-α（13.93 vs 109.10 pg/ml，P<0.0001）及IL-6（18.27 vs 61.15 pg/ml，P<0.0001）的表达均显著增高。（见图1）

图1.SCI模型评估。A）SCI组及生理盐水对照组体重变化曲线。B）H&E染观察SCI组及生理盐水组肺组织损伤情况。C）ELISA测定SCI组及生理盐水对照组血清IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-6表达。SCI：系统性慢性炎症；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；**P＜0.01；****P＜0.0001。

2.2SCI模型中TREM-1表达升高

TREM-1包含膜锚定形式TREM-1及可溶片段形式sTREM-1，与生理盐水组相比，SCI小鼠外周血清sTREM-1表达升高（8.64 vs 212.40 pg/ml，P<0.01），流式细胞测定小鼠外周血经典单核（CD11b⁺Ly6C⁺⁺）细胞TREM-1表达，结果显示SCI小鼠外周血经典单核细胞TREM-1表达升高（0.30%vs 13.81%，P<0.001）。

图2.TREM-1在SCI中的表达。A）ELISA测定小鼠血清中sTREM-1表达。B）流式细胞测定小鼠外周血经典单核细胞中TREM-1的表达。SCI：系统性慢性炎症；**P＜0.01；****P＜0.0001。

2.3sTREM-1预处理小鼠后经典单核细胞增加

采用不同浓度sTREM-1蛋白（250pg/ml，500pg/ml及1000pg/ml）尾静脉注射预处理小鼠，半小时后腹腔注射1mg/kg LPS，流式细胞测定小鼠外周血经典单核（CD11b⁺Ly6C⁺⁺）细胞表达，结果显示小鼠外周血经典单核细胞随sTREM-1蛋白刺激浓度的增加而增加。

图3.sTREM-1预处理小鼠后经典单核细胞的表达。*P＜0.05；**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001

2.4sTREM-1预处理小鼠后炎症表达增加

采用sTREM-1蛋白（1000pg/ml）尾静脉注射预处理小鼠，腹腔注射1mg/kg LPS后，ELISA测定血清中IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-6表达，与生理盐水组相比，LPS作用sTREM-1预处理小鼠后血清IL-1β（24h时，P＜0.0001）、IL-18（24h时，P＜0.0001）、TNF-α（6h时，P＜0.01；12h及24h时，P＜0.0001）及IL-6（12h及24h时，P＜0.0001）表达均显著升高。

图4.sTREM-1预处理小鼠后炎症表达。**P＜0.01；***P＜0.001；****P＜0.0001

2.5sTREM-1蛋白刺激THP1后炎症小体表达增加

采用sTREM-1蛋白刺激THP1细胞后，WB测定炎症小体AIM2、NLRP1及NLRP3表达，结果显示静息状态下，高浓度的sTREM-1重组分子能够刺激THP1细胞中NLRP3及NLRP1表达；炎症状态下，高浓度sTREM-1重组分子能够刺激THP1细胞中NLRP3、NLRP1炎症小体表达。

图5.不同浓度sTREM-1分子对单核细胞（THP1细胞）炎症小体表达的影响。**P<0.01，***P<0.001,****P<0.0001。

2.6抑制TREM-1后SCI小鼠炎症表达下降

SCI模型中采用LP17抑制TREM-1，ELISA测定血清炎症因子表达，结果显示IL-1β（56.79 vs 33.63 pg/ml，P<0.0001）、IL-18（121.70 vs 54.62 pg/ml，P<0.0001）、TNF-α（116.60 vs 64.05 pg/ml，P<0.0001）及IL-6（59.68 vs 31.21 pg/ml，P<0.01）表达下降（P＜0.05）。H&E染色显示肺泡间隔增厚、肺泡中单核细胞浸润等明显减轻，肺损伤评分升高（9.20 vs 5.40，P<0.001）。

图6.抑制TREM-1后SCI小鼠炎症表达。A）ELISA测定各组血清IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-6表达。B）H&E染色观察各组肺组织损伤情况。SCI：系统性慢性炎症；IL-1β：白介素-1β；TNF-α：肿瘤坏死因子-α；**P＜0.01；***P<0.001；****P＜0.0001。

2.7抑制TREM-1后NLRP3、caspase-1表达下降

SCI模型中LP17抑制TREM-1后，免疫组化法观察各组小鼠肺组织中NLRP3及caspase-1表达。结果显示，LP17抑制TREM-1后SCI小鼠肺组织中NLRP3表达、caspase-1表达下降（P<0.05）。

图7.抑制TREM-1后SCI小鼠肺组织中NLRP3、caspase-1表达。A）WB观察小鼠肺组织中NLRP3表达。B）WB观察小鼠肺组织中caspase-1表达。SCI：系统性慢性炎症；*P＜0.05。

3.讨论

SCI是机体免疫系统持续性激活而表现出的慢性、系统性全身炎症，不仅与某种慢性疾病相关，也与衰老、肿瘤等疾病发生发展相关，然而SCI持续激活的核心机制尚未完全阐明。本研究通过LPS诱导的SCI模型，结合分子生物学及药理学干预手段，提示了TREM-1通路在SCI中的表达及作用，为解析慢性炎症发生机制提供新视角。

作为革兰氏阴性菌的细胞壁中的主要成分，LPS可激活TLR4信号通路诱导急性炎症的发生。本研究通过多次腹腔注射LPS建立SCI模型，结果显示，模型组血清中IL-1β，IL-18，TNF-α及IL-6水平均呈显著升高，肺组织H&E染色组织可见肺泡结构破坏、间质水肿及以单核细胞为主的炎症细胞浸润等慢性炎症病理改变，这些特征与既往文献报道一致，表明模型构建成功，有趣的是，在本模型中，血浆TNF-α的升高趋势与既往研究结果相一致；然而，IL-6等炎症因子呈现出的显著升高，则提示慢性炎症过程中可能存在一个更为复杂且精细的细胞因子调控网络。

TREM-1作为免疫球蛋白超家族成员，包含膜锚定及可溶片段sTREM-1两种形式，膜锚定形式通过与TLR2（Toll样受体2，Toll-like receptor 2）、TLR3/9、TLR4相互作用，起放大炎症的作用。本研究发现，SCI模型中TREM-1表达升高，且下游炎症因子TNF-α、IL-6分泌增加。药理学抑制TREM-1（LP17处理）可使炎症因子水平下降50%左右，提示TREM-1通路激活是SCI的关键驱动因素，本研究扩大了TREM-1信号通路的病理角色：不仅在急性脓毒症中发挥了炎症放大作用，在慢性炎症中介导持续激活炎症。

sTREM-1是TREM-1的胞外片段，缺乏跨膜区和胞浆区，是TREM-1活化的特异性标志物。sTREM-1存在于体液中，可能来源于TREM-1 mRNA的可变剪接。由于sTREM-1分子与TREM-1具有相同的胞外片段，sTREM-1被认为与其同源促炎因子TREM-1发生竞争性拮抗，发挥抗炎作用。近年研究发现，sTREM-1能激活体外培养的肝星状细胞，分泌胶原蛋白-1和α-平滑肌肌动蛋白，从而促进纤维化发展，同样尾静脉注射sTREM-1也发现能加重小鼠的肝纤维化，而纤维化往往又是慢性炎症反复刺激的结果，提示sTREM-1可能参与了慢性炎症过程。我们研究前期发现sTREM-1作为慢性炎症独立危险因素^[11]，本研究采用sTREM-1蛋白预处理的脓毒症小鼠，小鼠外周血经典单核细胞表达升高，且与sTREM-1蛋白刺激浓度成正比，进一步研究发现，sTREM-1蛋白刺激使血清促炎症因子IL-1β、IL-18、TNF-α及IL-6表达升高，提示sTREM-1蛋白具有促炎作用。

本研究通过体外实验，采用sTREM-1蛋白刺激THP1细胞测炎症小体的表达，发现TREM-1可以促进NLRP3、NLRP1炎症小体的表达，体内实验采用LP17抑制TREM-1后，NLRP3炎症小体表达下降，提示慢性炎症中，TREM-1可通过NLRP3发挥作用，NLRP3炎症小体是一种存在于胞浆中的多蛋白复合物，主要是由NLRP3、ASC和caspase-1相互结合形成，是天然免疫系统的重要组成部分，NLRP3可通过激活caspase-1促进IL-1β及IL-18分泌。既往有研究表明NLRP3激活释放的HMGB1、IL-18活化TREM-1信号通路^[Pt A]，此类交叉对话部分解释了慢性炎症中单一通路抑制效果有限的原因，也为联合干预策略提供了理论依据。

参考文献：

[1]Rasmussen L J H,Petersen J E V,Eugen-Olsen J.Soluble Urokinase Plasminogen Activator Receptor(suPAR)as a Biomarker of Systemic Chronic Inflammation[J].Front Immunol,2021,12 780641.

[2]Franceschi C,Garagnani P,Vitale G,Capri M,Salvioli S.Inflammaging and'Garb-aging'[J].Trends Endocrinol Metab,2017,28(3):199-212.

[3]Sahota A,Naidu S,Jacobi A,Giannarelli C,Woodward M,Fayad Z A,Mani V.Atherosclerosis inflammation and burden in young adult smokers and vapers measured by PET/MR[J].Atherosclerosis,2021,325 110-116.

[4]Bouchon A,Dietrich J,Colonna M.Cutting edge:inflammatory responses can be triggered by TREM-1,a novel receptor expressed on neutrophils and monocytes[J].J Immunol,2000,164(10):4991-4995.

[5]Ogura Y,Sutterwala F S,Flavell R A.The inflammasome:first line of the immune response to cell stress[J].Cell,2006,126(4):659-662.

[6]Chang C,Gao Q,Deng G,Luo K,Zhu H.Diagnostic and prognostic predictive values of triggering receptor expressed on myeloid cell-1 expression in neonatal sepsis:A meta-analysis and systematic review[J].Front Pediatr,2022,10 929665.

[7]Cohen J.TREM-1 in sepsis[J].Lancet,2001,358(9284):776-778.

[8]Nathan C,Ding A.TREM-1:a new regulator of innate immunity in sepsis syndrome[J].Nat Med,2001,7(5):530-532.

[9]Wang Z,Chi H,Sun Y,Teng J,Feng T,Liu H,Cheng X,Ye J,Shi H,Hu Q,Jia J,Liu T,Wan L,Zhou Z,Qiao X,Yang C,Su Y.Serum sTREM-1 in adult-onset Still's disease:a novel biomarker of disease activity and a potential predictor of the chronic course[J].Rheumatology(Oxford),2020,59(11):3293-3302.

[10]Drenth J P,van der Meer J W.The inflammasome--a linebacker of innate defense[J].N Engl J Med,2006,355(7):730-732.

[11]Pauwels N S,Bracke K R,Dupont L L,Van Pottelberge G R,Provoost S,Vanden Berghe T,Vandenabeele P,Lambrecht B N,Joos G F,Brusselle G G.Role of IL-1αand the Nlrp3/caspase-1/IL-1βaxis in cigarette smoke-induced pulmonary inflammation and COPD[J].Eur Respir J,2011,38(5):1019-1028.

[12]Liao J,Liang Y,Liu Z,Xie Q,Zhang J M,Song S Y,Huang X,Cao L,Wang Y.Pyroptosis in acute respiratory distress syndrome and pulmonary fibrosis[J].Biomed Pharmacother,2025,189 118286.

[13]Zhu D,Zhao Q,Pan T,Bai L,Zhao Y,Wang J,Wang Z,Xu Y,Zhou X.Maiwei Yangfei decoction protects against pulmonary fibrosis by suppressing NLRP3 inflammasome-mediated pyroptosis of alveolar macrophage[J].Phytomedicine,2025,145 157041.

[14]Shi Z M,Jing J J,Xue Z J,Chen W J,Tang Y B,Chen D J,Qi X Y,Huang L,Zou Y Q,Wu X Z,Yang F.Stellate ganglion block ameliorated central post-stroke pain with comorbid anxiety and depression through inhibiting HIF-1α/NLRP3 signaling following thalamic hemorrhagic stroke[J].J Neuroinflammation,2023,20(1):82.

[15]Zhong W J,Liu T,Yang H H,Duan J X,Yang J T,Guan X X,Xiong J B,Zhang Y F,Zhang C Y,Zhou Y,Guan C X.TREM-1 governs NLRP3 inflammasome activation of macrophages by firing up glycolysis in acute lung injury[J].Int J Biol Sci,2023,19(1):242-257.

[16]Zhong W J,Zhang J,Duan J X,Zhang C Y,Ma S C,Li Y S,Yang N S,Yang H H,Xiong J B,Guan C X,Jiang Z X,You Z J,Zhou Y.TREM-1 triggers necroptosis of macrophages through mTOR-dependent mitochondrial fission during acute lung injury[J].J Transl Med,2023,21(1):179.

[17]Xu P,Zhang X,Liu Q,Xie Y,Shi X,Chen J,Li Y,Guo H,Sun R,Hong Y,Liu X,Xu G.Microglial TREM-1 receptor mediates neuroinflammatory injury via interaction with SYK in experimental ischemic stroke[J].Cell Death Dis,2019,10(8):555.

[18]Zhong W J,Duan J X,Liu T,Yang H H,Guan X X,Zhang C Y,Yang J T,Xiong J B,Zhou Y,Guan C X,Li Q.Activation of NLRP3 inflammasome up-regulates TREM-1 expression in murine macrophages via HMGB1 and IL-18[J].Int Immunopharmacol,2020,89(Pt A):107045.

基金项目：浙江省医药卫生科技计划项目（2022RC073）